应在什么时候使用梯度移动相?
在反相高效液相色谱工作状态下,当理想分离条件未知时,建议先尝试使用梯度溶剂。在30-50分钟内,这种试验方式可以让移动相内的有机组分含量处于10-80%的变动范围内,模拟出强度线性递增的洗脱条件。通过这种梯度洗脱尝试,可以探知适合等强度洗脱的移动相溶剂组成(小分子<1000g/mol),或者是一套适合多肽或更大分子分离的梯度条件。
梯度洗脱也可以被用于极性相差巨大的化合物间的分离。原则上,在做梯度溶剂洗脱尝试时,当有机相浓度梯度超过满量程的25%时才能检测到峰信号,则表明梯度洗脱很可能是解决分离问题的最佳手段。而当低于满量程的25%时就检测到样品出峰,则等强度洗脱方式最优,因为在等强度洗脱条件下填料对样品的选择性总处于最优状态。
如果样品由两组截然不同的化合物组成,分段洗脱可能会得到较好的分离效果。在这种情况下,首先使用等强度溶剂作为移动相,可以获得对于保留性较差的化合物组分较满意的分离效果,而后再一次性将移动相的洗脱强度提高到位,以实现对保留性相对较好的化合物组分的分离。分段梯度法也可以用于每次样品注射后的柱清洗操作中,以去除尚残留在柱上的杂质。
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